bca蛋白含量elisa试剂盒使用方法详细介绍
一、方法原理与核心步骤
BCA法基于蛋白质在碱性环境中将Cu²⁺还原为Cu⁺，后者与BCA试剂形成紫色络合物，其吸光度（OD值）与蛋白浓度成正比，最大吸收峰位于562nm（部分试剂盒支持540595nm范围） 。
标准流程包括：
1. 试剂准备：
BCA工作液按试剂A:B = 50:1现配现用，混合后需充分混匀（可能出现浑浊）。
标准品（如BSA）梯度稀释（02500 μg/mL），覆盖试剂盒线性范围（通常502000 μg/mL）。
2. 样品处理：
细胞/组织样品：用PBS或RIPA裂解后离心取上清；血清/血浆需澄清处理 。
稀释至检测范围内（若ΔA>1.5需预稀释），避免反复冻融（短期28°C，长期≤20°C）。
3. 加样与孵育：
96孔板中设置标准孔、样品孔、空白对照孔，每孔加样20μl 。
孵育条件：
传统法：37℃、3090分钟（灵敏度120 μg/mL） 。
快速法：室温5分钟（如Pierce Rapid Gold试剂盒），准确性媲美传统法 。
4. 洗涤与显色：
弃液后以洗涤液（350μl/孔）洗板5次 。
加TMB底物避光孵育1015分钟，终止液（如2M硫酸）终止反应 。
5. OD值读取：
立即在562nm主波长测量（630nm或570nm可作参比波长） 。
二、浓度计算与标准曲线绘制
1. 数据处理：
计算ΔA（样品OD 空白OD） 。
以标准品浓度（X轴）对应ΔA（Y轴）绘制曲线，推荐四参数逻辑拟合 。
2. 浓度换算：
代入曲线方程 y = kx + b，乘以稀释倍数 。
示例：若稀释10倍后计算浓度为50μg/mL，则实际浓度为500μg/mL。
三、关键影响因素与优化策略
1. 孵育条件的平衡：
速度vs灵敏度：
| 方法 | 孵育条件 | 检测限 | 适用场景
| 传统BCA | 37℃、3090min | 510 μg/mL | 高精度低浓度样品 |
| 快速BCA | 室温、5min | 1 μg/mL | 高通量筛查、时间敏感实验 |
| 增强型BCA | 60℃、30min | <5 μg/mL | 极低浓度样品 |
2. 干扰物控制：
EDTA：浓度必须<10mM（螯合铜离子导致假阴性） 。
还原剂（DTT、β巯基乙醇） ：>1mM时严重干扰，建议改用Bradford法或透析去除 。
表面活性剂：避免Triton X100、NP40，推荐0.1% SDS替代 。
四、误差排查与质控要点
1. 常见问题及解决方案：
| 问题现象 | 可能原因 | 解决策略 |
| 标准曲线线性差 | 标准品降解/配制错误 | 现配现用，核对稀释步骤 |
| 样品OD值超范围 | 蛋白浓度过高 | 预稀释至ΔA<1.5 |
| 孔间重复性差 | 加样不均/洗涤不彻底 | 使用多通道移液器，确保洗板5次 |
| 背景值过高 | 样品中含色素/脂质 | 离心澄清或改用Bradford法 |
2. 质控实验：
回收率测试：加标已知浓度蛋白，回收率应达90110% 。
精密度验证：室内/室间重复检测CV值<10% 。
五、快速BCA法与传统方法性能对比
| 参数 | 传统BCA法 | 5分钟快速BCA法 |
| 孵育时间 | 3090分钟 | 5分钟 |
| 检测限 | 510 μg/mL | 1 μg/mL |
| 线性范围 | 202000 μg/mL | 2010000 μg/mL |
| 蛋白质间变异系数 | 较高（尤其不同蛋白类型） | ≤10% |
| 适用场景 | 高精度科研 | 高通量筛选、临床诊断 |
> 注：原鑫生物提醒您，快速法在室温下5分钟即可达到与传统法30分钟相当的显色强度，且动态范围扩大5倍，但需严格控温（>15℃） 。
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